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做实验 | 学会这些酶切技术,告别科研被动996~
发布时间:2019-04-29 | 浏览:281次 【关闭此页

       限制性内切酶可以特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。


       在平常酶切实验中,

       总有一些因素导致结果不理想,

       那么做好酶切应该注意哪些问题呢?

       操作步骤中应注意哪些关键因素呢?

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       如何做好酶切实验



一、DNA质量

       ▲DNA的质量是决定酶切效率的最重要的因素。通常在克隆时,如果反复优化酶切条件后,都不能实现完全酶切,最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题;


       ▲DNA的质量检测通常有两个方法:首先OD260/280比值应该在1.8左右(1.7-1.9),否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次,琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主,最多不超过三条带(分别为超螺旋DNA,线性化DNA和环状DNA),否则意味着质粒DNA的质量不高,应该重新制备。


二、样品纯度

       DNA中的杂质,如:氯仿、乙醇、SDS等,都会影响酶的活性。

       一般采取以下措施:

       ▲纯化DNA;

       ▲加大酶用量;

       ▲延长酶催化反应的保温时间;

       ▲扩大反应体系(>20ul)。


三、甲基化影响

       从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA,其碱基的一部分已经被甲基化,因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶,也几乎无法切断被甲基化的部分。被甲基化的部位,根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。例如宿主菌为大肠杆菌的情况下,根据宿主的种类有以下两种情况:


       在进行转化时,通常使用C600、HB101、JM109等菌株,因为都带有dam、dcm甲基化酶,所以使用这些菌株制备的DNA时,必须注意!另外,动物DNA中CG序列多为5mCG,植物DNA中CG及CNG序列多为5mCG和5mCNG。


四、反应温度

       大部分酶的反应温度为37°C,从嗜热菌中分离出来的内切酶则有更高的要求温度,一般为50-65°C不等。


五、DNA分子结构

       DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性有很大影响,某些限制性内切酶在切割超螺旋的质粒时需要的酶量比切割线性DNA时要高很多。


六、缓冲液

       对于每一种酶都有相应的最佳缓冲液(不同公司的同一种buffer可以互换使用哦~),可保证几乎100%的酶活性,所以应选择合适的缓冲液,使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA才可实现最佳活性,在这种情况下,也相应有100X(如NEB公司)或10X(如Takara公司)的BSA,不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。


七、反应时间

       ▲对于酶切鉴定试验(加酶量0.5-1μl,反应体系10-20μl,质粒DNA量在50-200ng),反应时间2-4h(如果时间比较紧的话可以1-2h);

       ▲对于酶切后用于胶回收(加酶量1-2μl,反应体系30-50μl,DNA量在500-2000ng),反应时间3-6h;

       ▲对于反应条件不是很合适的时候(如双酶切时有一个酶的反应buffer不是很合适或者酶切位点在线性DNA的末端)最长16h。

       ▲为防止Star活性的产生,应将甘油的浓度控制在5%以下,要注意酶的体积不要超过总体积的10%(一般酶都贮存于50%的甘油中)。同时如果酶切时间过长可能会导致基因被切碎。


       DNA酶切出现意外怎么应对?

       不完全酶切或者完全切不开


       ▲可能原因❶:内切酶失活

       ▲推荐解决方案:

       1.查看内切酶的有效期;

       2.确保内切酶储存在-20℃,再低于此温度,内切酶活性可能受影响;

       3.避免多次冻融(不超过3次),建议使用冰盒储存或取放内切酶;

       4.勿将酶储存于无霜冰箱或冰箱开门处:

 

       ▲可能原因❷:酶切方案不佳

       ▲推荐解决方案:

       1.按照内切酶供应商推荐的酶切方案及其所适用的DNA样本类型;

       2.确保酶切反应中包含所需的添加物或酶辅因子(如DTT、Mg2+、ATP、活性腺苷甲硫胺酸);

       3.使用随酶提供的酶切缓冲液。双酶切时,按供应商的推荐,需考虑兼容性及其它所需反应条件;

       4.按照供应商推荐的最适酶切温度进行酶切,双酶切时若两种内切酶最适温度不一致,按顺序先进行较低温度酶切,再进行较高温度酶切;

       5.确保酶切过程中不会因蒸发而使酶切体积减小,否则会使盐浓度增高,从而可能降低酶的活性


       ▲可能原因❸:内切酶不恰当的稀释

       ▲推荐解决方案:

       1.避免使用微量体积(<0.5μL)内切酶进行酶切,保证足量日常储备,确保每个反应所加酶量准确;

       2.勿将内切酶稀释于水或10×反应缓冲液中;

 

       ▲可能原因❹:配制酶切体系不恰当

       ▲推荐解决方案:

       1.在反应体系中最后加入内切酶,加入内切酶后轻弹混匀,确保内切酶不会因甘油密度而沉于管底;

 

       ▲可能原因❺:酶切反应混合液中甘油过多

       ▲推荐解决方案:

       1.酶切反应混合液中甘油浓度应<5%,加入内切酶的量不超过总反应体积的1/10,尤其是对于双酶切;

       2.避免因蒸发而使反应体积减小,从而导致甘油浓度增高;


       ▲可能原因❻:酶切DNA浓度不合适

       ▲推荐解决方案:

       1.酶切反应混合液中DNA浓度的最佳范围为20-100 ng/µL;


       ▲可能原因❼:DNA污染

       ▲推荐解决方案:

       1.通过离心柱纯化、酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除残留的SDS、EDTA、蛋白、盐分、核酸酶,用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀,以去除EDTA和盐分;

       2.当酶切未经纯化的PCR产物时,PCR产物体积应不超过酶切总体积的1/3(如30 µL酶切总体积中PCR产物体积不超过10 µL);

       3.如果DNA是经硅膜或树脂纯化,需>10000×g离心10分钟已去除残余粒子;

 

       ▲可能原因❽:DNA中找不到内切酶识别序列

       ▲推荐解决方案:

       1.重新检查DNA模板,或通过测序检查;

       2.如果通过PCR引物引入酶切识别序列,确保引物序列包含酶切识别序列且5’端有4-8个保护碱基;

       3.查看所用内切酶是否需要不止一个识别位点才能发挥完全活性,添加含识别序列的DNA寡核苷酸或亚精胺可提高那些至少需要两个识别位点内切酶的活性(如AarI、SfiI);

 

       ▲可能原因❾:甲基化影响

       ▲推荐解决方案:

       1.查看内切酶的甲基化敏感性。如果内切酶受识别序列甲基化影响,尝试用异裂酶或同裂酶替代(如MvaI替代EcoRII);

       2.为了避免DNA的甲基化,在dam–/dcm–型大肠杆菌中复制质粒;

       3.如果内切酶需要识别序列甲基化才能发挥功能(如DpnI、SgeI),在dam+/dcm+型大肠杆菌中复制质粒;

 

       ▲可能原因❿:DNA结构影响

       ▲推荐解决方案:

       1.对于超螺旋的质粒DNA,其酶切位点可能被包埋,使用经验证可消化完整质粒的内切酶,如有必要,适当加大酶用量(如每µg DNA 5-10 units酶);

       2.对于线性DNA而酶切位点临近末端,检查完全酶切所需的额外碱基;

       3.如果在质粒多克隆位点内进行双酶切,检查酶切位点临近序列,是否具有进行完全酶切所需的碱基数量,如果距离太近,两种酶切可能会互相影响;

 

       ▲可能原因⓫:水中有杂质

       ▲推荐解决方案:

       1.将水离心(10 min, 10000×g)以去除水中污染物;

       2.做阴性酶切对照,以水代替酶以检测水中核酸酶和细菌污染物的影响;

       3.推荐使用新鲜的无核酸酶、分子生物学级别的商品化水;

 

       出现预期外的酶切条带


       ▲可能原因①:内切酶星号活性

       ▲推荐解决方案:

       1.酶用量不要超过推荐用量,如有必要可适当减少酶用量;

       2.避免过度长时间酶切;

       3.使用推荐的反应缓冲液。低盐、不合适的PH、除了Mg2+外的二价阳离子可能引起星号活性;

       4.确保酶切反应中甘油浓度不超过5%;

       5.避免因蒸发而使反应体积减小,进而增大甘油浓度和盐浓度;


       ▲可能原因②:其它内切酶污染

       ▲推荐解决方案:

       1.使用一管新酶或新缓冲液,不恰当的实验操作可能使内切酶或缓冲液被另一种内切酶污染;

 

       ▲可能原因③:其它DNA污染

       ▲推荐解决方案:

       1.重新制备新的样本DNA;

 

       出现弥散的DNA条带


       ▲可能原因❶:DNA质量差

       ▲推荐解决方案:

       1.通过电泳检测未酶切的DNA,如观察到降解则重新纯化DNA;

 

       ▲可能原因❷:试剂污染

       ▲推荐解决方案:

       1.如有必要,制备新的试剂,使用新的内切酶或者重新纯化DNA,不恰当的操作可能使反应组分被核酸酶污染;

 

       ▲可能原因❸:DNA迁移缓慢

       ▲推荐解决方案:

       1.在电泳前加入含0.2% SDS上样缓冲液后,将酶切DNA在65℃加热10分钟,可使与底物DNA仍结合的酶分离;

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