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做实验 | 细胞周期检测太难太复杂?盘他~
发布时间:2019-04-04 | 浏览:196次 【关闭此页

细胞量不够?细胞碎片太多?

导致实验一次次重复?盘他!

教你如何把细胞周期的数据

变的更加漂亮,准确!


       细胞周期简介


       流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法,细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间,它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程。


       主要分为以下2大过程:

       ▲分裂间期:间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期);

       ▲分裂期M期:细胞分裂期,指细胞分裂开始到结束。


       实验步骤


       1. 细胞培养:取对数生长期的细胞,按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内,进行所需的处理(比如加入药物),特定时间后终止培养,进行下一步的实验。

       2. 细胞固定:800rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。

       3. 细胞染色:800rpm离心5min,弃上清,以3mL的PBS洗涤一次,加入400uL溴化乙锭(PI,50ug/mL),100ulRNaseA(100ug/mL ),4℃避光孵育60min。

       4. 流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2~3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。注:上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞!因为PI具有很强的粘附性,容易使细胞聚团!


       常见问题解答


       1.是否可以直接用乙醇固定细胞?

       不可以,直接70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象,很难重悬成单细胞,影响固定效果,甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是:待细胞充分分散成单细胞后,缓慢地滴入无水乙醇中,使其终浓度为70~75%乙醇。


       2.细胞量过少,无法获得数据结果?

       ▲首先,要保证收集足够的细胞样品(个人经验至少收集100万左右);如果药物处理后细胞死亡过多,应该降低药物浓度;

       ▲其次,固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞,再逐滴滴入无水乙醇中;

细胞清洗时,不可过度吹打细胞,以防产生过多的细胞碎片;

       ▲最后,尽量采用尖底的离心管和水平的离心机,离心后尽量用移液枪吸走上清,不要倾倒,残留一点,不要吸完;


       3.什么样的数据结果可以用?

       ▲G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍,在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰;

       ▲CV(变异系数)表示峰的宽度,CV值越小,峰形越好,最好是在5%左右,一般小于10%也被认可。

       ▲RCS最好是在1~3,高于5则不被认可。RCS高,说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大,可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好,或者是PI的浓度不佳造成的。



       4.如何提高分辨率和精确度?

       变异系数(Coefficient of Variation,CV值)反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为样品固有,与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分,可以减少样本的CV值,提高G0/G1峰分辨率和精确度。


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