资讯中心
技术文章当前所在位置:首页 -> 资讯中心 -> 技术文章 -> 详细信息
做实验 | 细胞凋亡检测,TUNEL染色锦鲤篇(下)
发布时间:2019-01-07 | 浏览:477次 【关闭此页

<东澳生物实验结果图,盗图必究!>

   TUNEL法是DNA 末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记的方法。这种方法在科学研究中已被广泛使用。但是由于影响DNA断裂的因素很多,TUNEL检测中的操作不恰当可能会引起假阳性或者假阴性的结果,不能体现正确的实验结果,从取材、组织处理、染色到结果判定,有这些操作细节需要警惕~ 



   6.影响TUNEL染色的一些操作细节


   由于TUNEL操作步骤多,在实验操作中往往由于细节上的疏忽使实验失败。总结多年操作经验,应注意以下问题:


   1)阳性对照

   实验前应选择好阳性对照切片。一般试剂公司会提供1-2张阳性对照,如果没有可以选择凋亡细胞比较多的有生发中心的淋巴结作为阳性对照。这一点非常重要, 它是评价所有操作过程的准确性和可靠性的阳性标准。

   2)阴性对照

   阴性对照是实验标本不加TDT进行温箱孵育, 是控制结果质量的重要参照。

   3)DNA的暴露方法

   由于DNA在细胞核内,必须经过一定的处理才能暴露出来。目前文献中暴露DNA的方法有多种,如枸橼酸盐的微波修复、高压修复、蛋白酶k的消化等。到底哪种方式好,应该遵照说明书的操作规程来做,因为每个生产商在产品出厂之前会对该产品进行测试,一般来说说明书上所说的暴露方法为最佳方法。我们不能一味最求高阳性率而改变操作方式。当然即使是用说明书上的操作程序有些也是需要操作者来摸索的。例如蛋白酶k的消化时间和浓度,不同的组织以及组织的新旧都会影响其作用效果。

   4)孵育温度

   有些实验者往往不在意孵育温度,其实这也是影响实验结果的重要因素。室温不是恒定的,只有保持恒定的条件你的实验结果才可信,才有可比性和重复性。我们提倡用37℃的温箱进行孵育,孵育过程中要使用盖玻片、塑料薄膜或其它能将孵育液盖住的物质,防止孵育液的挥发。

<东澳生物实验室实拍图,盗图必究!>


   5)操作中切片的干燥与湿润

   这在比较早的试剂盒由于显色方法的单一性不存在这样的问题。但目前的TUNEL试剂盒大都有两种显色方法,即可用荧光显微镜观察,也可用DAB显色后使用普通的生物显微镜观察。试剂盒往往说这两种方法都能得到很好的结果。但是我们的经验告诉我们,如果使用荧光显微镜观察,在滴加TUNEL反应液(TDT液)和标记荧光素抗体的HRP前,必须保持切片干燥,这样能使荧光素牢固地与TDT结合,荧光强度最佳。如果使用普通的生物显微镜观察则正好相反,实验中必须保持切片的湿润,如果在滴加TUNEL反应液(TDT液)和标记荧光素抗体的HRP前切片干燥,会产生严重的背景色,影响观察。因此,实验者应根据需求采用最佳的方法。


   6)控制显色时间

   应严格观察阳性和阴性对照组细胞核的显色时间,一旦阳性对照组细胞核显现出棕黄色应立即停止,如果阴性对照组有背景显色,则提示显色过度,可能出现假阳性结果。高质量的阳性结果是高倍镜下细胞核被染成棕黄色,而细胞的其他成分不显色。至于是否对切片进行套染,这并不重要,套染主张用甲基绿或苏木素。

<东澳生物实验室实拍图,盗图必究!>



   7.TUNEL染色阳性结果的判断


   这是实验的最后一步,也是最关键的一步。光镜下凋亡一般累及单个或少数几个细胞,凋亡细胞呈圆形,HE染色下胞浆红染,细胞核染色质聚集成团块状。由于凋亡细胞迅速被吞噬,又无炎症反应,因此,在常规切片检查时,一般不易发现,但在某些组织如反应性增生的次级淋巴滤泡生发中心则易见到。TUNEL染色下凋亡细胞核为棕黄色,单个细胞或散在存在,多存在于坏死与正常组织的交界处,在坏死的组织中凋亡细胞反而少见。背景为无色或复染后的绿色或蓝紫色。

标签:
上一条:做实验 | 吉姆萨染色“助攻”凋亡细胞检测
下一条:做实验 | 细胞凋亡检测,TUNEL染色锦鲤篇(上)
点击关闭
展开