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做实验 | 细胞凋亡检测,TUNEL染色锦鲤篇(上)
发布时间:2019-01-02 | 浏览:401次 【关闭此页

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    TUNEL法是DNA 末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记的方法。这种方法在科学研究中已被广泛使用。但是由于影响DNA断裂的因素很多,TUNEL检测中的操作不恰当可能会引起假阳性或者假阴性的结果,不能体现正确的实验结果,从取材、组织处理、染色到结果判定,有这些操作细节需要警惕~ 


    取材方式对TUNEL染色的影响


    动物实验一般有以下三种方式进行取材:


    1.麻醉处死后取材

    是将动物用麻醉剂麻醉后断头或脱颈椎处死后取材。优点是取材速度快,缺点是动物死亡后会导致脏器的淤血。


    2.麻醉后心脏灌流取材

    是将动物麻醉后先用生理盐水从主动脉灌流,待动物体内血液冲洗干净后再用固定剂进行灌流,直到动物身体僵硬死亡,这种取材方式能最大限度地使动物组织器官及时得到固定,缺点是不能取血,无法获得血液标本。


    3.麻醉后腹主动脉取血后再取材

    是将动物麻醉后,先用注射器从腹主动脉将血液抽出,再进行取材。优点是能同时获得血液和组织脏器多种标本,缺点是动物取血后会导致脏器的失血性反应,某些抗原抗体(如磷酸化等一些易被激活的抗体)会产生一定的影响。


    这几种取材方法中我们提倡使用第二种,可以将组织在未离体的情况下先行固定,极大地保留了组织的原始状态,能真正体现实验结果的准确性。第一种和第三种方法取材,动物脏器处于失血或瘀血状态,会产生一定的应激反应,会影响实验结果的稳定性和可靠性。



    取材大小对TUNEL染色的影响


    取材大小直接影响固定剂穿透组织的速度。即使是动物组织也不要过大,更不能将整个脏器直接放入固定剂内。如肝脏取材只取1-2叶肝脏即可,并将其切成约5mm左右的一段或者两段,待24h后再二次取材,切成2-3mm厚度的组织块。肺脏和大脑也是一样。肾脏取材后要将肾脏冠状面剖开,待初步固定后再二次取材。消化道的取材要用生理盐水将内容物轻轻清洗干净再取材。其它组织如胸腺、甲状腺、气管、脑垂体等可直接放入固定液内。

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    固定剂的选择对TUNEL染色的影响


    由于取材后的组织还要进行免疫组化等其它指标的检测,必须先进行固定,石蜡包埋。含有甲醛的固定剂及组织透明过程中使用的二甲苯都会影响DNA的结构,破坏DNA链,使之断裂[1]。我们平时经常使用的10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液,甲醛能使DNA断裂,容易造成假阳性结果[2]。因此我们推荐使用含有乙醇的Carnoy固定液,它穿透能力强,可很好的固定细胞质和细胞核,有效保证组织抗原抗体的稳定性的同时也能有效保证细胞核内DNA与RNA的结构。


    组织离体后的缺血时间对染色的影响


    即组织取材后到放入固定剂的时间间隔。如果间隔时间过长,组织离体缺血缺氧会发生变性甚至坏死,DNA也会断裂、溶解影响实验结果[3]。动物实验组织取材后往往需要称重等操作,会延长组织的离体缺血时间。我们认为组织离体后到放入固定剂的时间越短越好,最好的办法是组织的原位灌注固定,但如果条件不允许也不要超过60min。


    固定时间的长短对TUNEL染色的影响


    组织在固定剂内时间过长与过短均可影响蛋白质和核酸的结构。甲醛可使DNA断裂,因此组织在甲醛或多聚甲醛内的时间不宜超过72h。Carnoy固定液虽然不含甲醛,但是由于所含的氯仿具有一定的挥发性,时间过长固定液的效果降低,因此也控制在72h内为佳。

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